紫外可見分光光度計的工作原理主要是基于朗伯-比耳定律。18世紀初，瑯伯在前人的基礎上，進一步研究了物質對光的吸收與物質厚度的關系，并于1760年指出：如果溶液的濃度一定，則光對物質的吸收程度與它通過的溶液厚度成正比，這就是朗伯定律，其數學表達式為：
A=lgI。/I=K。b
式中，A為吸光度；
I為入射光強度；
I為透射光強度；
b為液層厚度（即光程）；
K為比例常數。
1852年，比耳研究了各種無機鹽的水溶液對紅光的吸收后指出：光的吸收和光所遇到的吸光度的數量有關；如果吸光物質于不吸光的溶劑中，則吸光度和吸光物質的濃度成正比，這就是比耳定 律，其數學表達式為：
A=lgI。/I=K1C
式中，A為吸光度；
I為入射光強度；
I為透射光強度；
C為溶液的濃度；
K1為比例常數。
將朗伯定律和比耳定律結合起來，則為朗伯-比耳定律，公式如下：
A=lgI。/I=K2bC
式中，A為吸光度；
I為入射光強度；
I為透射光強度；
C為溶液的濃度；
b為液層厚度（即光程）；
K2為比例常數。
朗伯-比耳定律認為：當一束光平行的單色光通過某一均勻的有色溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度和光程的乘積成正比，這就是朗伯-比耳定律的真正物理意義，它是光度分析中定量分析的最基礎、最根本的依據，也是紫外可見分光光度計的基本原理。
分光光度計正是根據朗伯-比耳定律，對物質進行定量和定性分析的。
